超低温保存为液氮(-196℃)低温下的保存，在此温度下，植物材料的物质代谢和生命活动几乎完全停止。超低温保存技术具有长期性和稳定性的优点，是植物种质保存的有效方法，也是果树品种改良和分子遗传学研究的前提和基础。

    随着现代果品业的发展，种质资源的重要性越来越被重视。传统的果树种质资源保存方法是将引来的品种进行样地栽培，这种方法存在着不可避免的缺陷：首先，大量的种质栽培需占用大面积的土地，管理费用高。其次，在此过程中易发生自然变异和种质退化，从而影响种质的遗传品质。第三，由于自然的和人为的因素，有可能造成种质资源的灭绝。

    将超低温保存技术与组织培养技术相结合，可以将大量的果树种质以芽、茎尖分生组织、组织培养物、胚轴等形式储存在液氮罐中，这种保存形式的优点是果树的种质保存不受土地、人力等条件的限制，且取材方便、效率高，极大的节省开支，此外，可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交换。

1材料的选择
    由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存效果有较大的影响[9]，从而要求在整个保存处理过程中采取相应的符合其材料特性的各种措施。不同基因型的植物材料对超低温保存的反应各不相同，冻后存活率的显著差异不仅存在于种间，而且存在于不同品系间。植物细胞培养物的生长年龄是决定冻存后细胞存活率的重要因素之一，植物抗冻性的提高与细胞的分裂和生长等各种生命活动有密切关系。赵艳华等在包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖时，发现材料的生理状态对茎尖存活率的影响甚至比保存过程中处理因素的影响更大。因此，在进行超低温保存前，对材料的选择十分重要。可以进行超低温保存的材料种类很多，主要分为四类:l)茎尖和侧生分生组织;2)原生质体;3)悬浮培养物，愈伤组织和体细胞胚;4)其他植物器官如胚、子房、花粉、花药、种子等。

2材料预处理
    为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，必须对材料进行预处理[25].不同材料在超低温保存过程中要求不同的生理特性，进行预处理的方法也就各异。总原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水含量，增强细胞抗寒力[26]。具体方法有如下三种。
2.1低温锻炼
    低温又称冷驯化。在降低温度时，细胞膜发生膜脂相变，即膜脂由液晶态向凝胶态转变，相变温度越低抗寒力越强。低温锻炼可提高膜磷酸脂的不饱和程度而增加抗低温的能力。此外，经过低温锻炼，细胞发生保护性脱水，从而免遭细胞内大量结冰引起细胞死亡。研究还发现，低温锻炼可以使细胞液泡发生内吞作用，将细胞质中的大分子物质吞入，提高液泡渗透势，阻止冰核的形成，出现过冷状态即低于水(溶液)的凝固点却不结冰的现象[28]。另外，低温可以诱导产生抗冻蛋白，在抗寒品种小苹果类如铃档果、黄海棠等体内己发现此类抗冻蛋白，其抗冻机理是当细胞内水分形成冰核后，抗冻蛋白与之结合，阻止冰核的扩大，起到抗冻的效果。目前，已经分离得到了抗冻蛋白基因，正在开展基因工程方面的研究。李嘉瑞等发现正常温度下培养的称猴桃愈伤组织在5℃条件下培养1d，然后0℃培养3d，再在-1~-3℃下培养2d，经过这样的低温锻炼后其超低温保存成活率大大提高。
2.2继代培养
    继代培养可增加植物有丝分裂细胞的数目，有丝分裂前后的细胞抗冻能力强，处于该时期的细胞超低温保存后成活率较高，因而可通过继代培养提高细胞分裂与分化的同步化频率，从而提高超低温保存的存活率。
2.3预培养
 在    培养基中加入冰冻保护剂或诱导抗寒力的物质，如山梨醇、蔗糖、丙二醇、二甲基亚飒、脱落酸(ABA)等，可以提高材料的存活率。该法己经在许多植物获得成功，是应用广泛的一种预处理方法，该法经常与冷驯化结合使用，进一步提高存活率。Niino等将离体的樱桃茎尖在固体MS+0.7mol.L-1蔗糖培养基上5℃条件下预培养1d，冻存后存活率达80%以上。Leena在超低温保存银杏离体茎尖时发现:在附加10-4mol.L-1脱落酸的WPM培养基上，5℃条件下低温锻炼28d，可显著提高低温锻炼的效果。

3冰冻保护剂
    目前使用的冰冻保护剂的种类很多，按其是否能渗透到细胞内，可将冰冻保护剂分为两类:I)渗透性冰冻保护剂，包括二甲基亚砚、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酞胺等，此类冰冻保护剂多数为低分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的枯性增加，弱化了水的结晶过程，从而起到了保护效果;2)非渗透性冰冻保护剂，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等，这类物质能溶于水，但不能进入细胞，它能使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。Growe等发现海藻糖能与磷脂相互作用而稳定细胞膜结构，防止冰冻对细胞膜造成直接损伤，因而它也被用作冰冻保护剂。Bhandal等用海藻糖作唯一的冰冻保护剂，成功地保存了胡萝卜、烟草等细胞培养物。另外，脯氨酸也可作为冰冻保护剂起到稳定冻存细胞中的蛋白质结构的效果。
    实验发现，单独使用一种冰冻保护剂，其保存效果并不理想，近几年来，国内外许多研究都在尝试采用复合冰冻保护剂。复合冰冻保护剂的优越性在于它能充分发挥各种成分的保护作用，从而产生累加效应。10%或5%二甲基亚砚(DMSO)配合一定浓度的甘油或糖，能显著提高超低温保存后的成活率，而其中糖的种类也因保存材料不同而异。作为冰冻保护剂应具备以下三个特性:l)易溶于水;2)在适当的浓度范围内是无毒的;3)化冻后易从保存材料中清除。另外，冰冻保护剂处理应在低温下进行，而且处理时间不宜过长，一般为20~120min。如桑芽用0.5mol.L-1，山梨糖醇液浸渍过夜，再用10%DMSO与0.5mol.L-1，山梨糖醇液浸渍处理20min，能显著提高超低温保存后的成活率。

4冰冻方法
    随着国内外对超低温保存研究的进一步深入，出现了许多种冰冻方法，但是，没有一种方法普遍适用于任何植物材料，所以必须因材料而异来确定方法。
4.1快速冰冻法
    该法要求将材料从0℃或者其它预处理温度直接投入液氮内，其降温速度在1000℃/min以上。此法利用了植物细胞内水分无晶核形成的玻璃化过程，它适合于高度脱水的植物材料，如种子、花粉等。
4.2慢速冰冻法
    该法采用逐步降温的方法，以1~2℃/min从0℃降到-100℃左右，再立即浸入液氮。逐步降温过程中，可以使细胞内水分有充分的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。慢速冰冻方法比较适合于液泡化程度较高的植物材料。
4.3两步冰冻法
    该法综合了以上两种方法的特点，即首先用慢速冰冻方法从0℃降到一定的预冷温度，使细胞进行适当地保护性脱水，再立即浸入液氮迅速冰冻。目前，常采用0.5~4℃/min降温速度，降到-40℃，再立即浸入液氮。
4.4逐级冰冻法
    植物材料经过冰冻保护剂O℃预处理后，逐级通过-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等，每级温度停留5min左右，然后浸入液氮。
4.5干燥冰冻法
    将具有干燥耐性或者经过诱导产生干燥耐性的果树茎尖用流动无菌空气进行干燥处理，然后置液氮中冷冻保存。对经过低温硬化和预备培养的苹果茎尖进行干燥处理，水分含量降到22%时用液氮保存，解冻后置床培养，种苗成活率为50%。经过硬化和预备培养的苹果茎尖，先包入添加蔗糖的精氨酸空粒中干燥，当水分含量达30%左右时置液氮中保存，解冻后置床培养，种苗成活率为80%。该法己经在许多果树如苹果、梨、葡萄等的茎尖保存上取得成功。
4.6脱水冰冻法
    此法先用含有甘油和糖(1~3mol.L-1)的防冻剂进行浸透脱水，再置于-20℃~-30℃冷藏库内冻结脱水，然后立即浸入液氮中迅速冰冻。例如梨树茎尖的保存，先把培养的茎尖在5℃条件下放置3周使其硬化，再在5℃条件下，在防冻剂(0.4mol. L-1山梨糖醇和1.25mol.L-1，甘油)中浸渍约18h进行浸透脱水，再置于-20℃~-30℃冷藏库内进行1h冻结脱水，最后用液氮保存，解冻后置床培养，种苗成活率达70%。
4.7玻璃化法
    溶液在降温时，如果缺乏均一品核生长条件或生长所需的足够时间，就成为过冷的溶液，它是低于冰点而不结冰的液态。继续降温，均一品核开始形成，此时的温度称为均一晶核形成温度，也称过冷点。继续降温过程中如果降温速度不够快，则在保存的植物材料中形成尖锐的冰晶:若快速降温，植物材料中的均一品核就很少或几乎没有形成，溶液就进入一种无定型的玻璃化状态。此状态下没有冰品对细胞的损伤，因而植物材料的存活率大大提高。依此原理进行的保存方法称作玻璃化超低温保存。
 其实，在以上前六种方法中也存在玻璃化过程，只不过是部分玻璃化，即细胞内玻璃化。而该方法为完全玻璃化法，经高浓度保护剂作用后，植物组织(包括细胞内外)连同保护剂本身在快速降温中都进入玻璃化。研究发现，复合保护剂比单一保护剂更易进入玻璃化，因此，筛选新的复合型保护剂是促进人工玻璃化的有效途径。1985年，Rall与Fahy首次提出了一种有效的玻璃化溶液（VSL），其中包含了20.5%DMSO、15.5%乙酞胺、10%丙二醇，6%聚乙二醇(W/V)，这是应用高浓度玻璃化溶液慢速降温实现玻璃化的首次突破性进展。1990年，Sakai等提出了玻璃化冰冻剂PVS2配方，即基本培养基MS附加30%甘油、15%乙二醇、15%DMSO(w/v)和0.5mol.L-1蔗糖，并成功冻存了脐橙培养细胞.
     玻璃化冻存的关键在于严格控制植物材料在玻璃化保护剂中的脱水时间，材料的脱水时间具有种的特异性[43]。25℃脱水时，脐橙培养细胞为3min;苹果和梨的茎尖为80~90min。Niino等在研究离体樱桃茎尖保存时，发现茎尖长度不同要求的脱水时间也不相同，茎尖长度增加时脱水时间也应延长。玻璃化超低温保存方法比其它方法具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优点，并在保存器官和组织结构的完整性方面有独到之处。
4.8包埋干燥法
    Dereuddre和Plessis等探讨了包理技术在植物茎尖等分生组织上的应用，他们采用藻酸钠包理技术将试材在包埋丸中缓慢脱水至适宜含水量，提高了超低温保存的存活率。1992年Niino等采用包埋干燥法保存了5个苹果品种的离体茎尖得到了较高的存活率。在国内，此项研究起步较晚，赵艳华用包埋干燥超低温技术保存苹果离体茎尖，获得了成功。包埋干燥法操作程序如下:首先将试管材料置于5℃光照培养箱中进行低温锻炼3周，无菌条件下切取其茎尖，在含高浓度蔗糖的MS培养液中预培养，然后转移到含3%藻酸钠的无钙培养液中，吸取含一个茎尖的液体滴至含100mmol. L-1氯化钙及0.5mol. L-1，蔗糖的培养液中，保持30min，取出在流动无菌空气中干燥，之后装入冷冻管，按两步降温法降温，随后投入液氮。包埋干燥法既省去了传统慢速降温方法对昂贵降温仪器的依赖，又避免了玻璃化法中高浓度保护剂对茎尖的毒害作用，因而保存过程对茎尖的损伤更小，化冻后大部分茎尖仍能保持绿色，并很快长出嫩叶。

5超低温保存中超微结构的变化
    研究果树茎尖及其它分生组织的超低温保存技术，可以通过观测预培养、保护剂处理、冷冻及恢复生长等超低温保存系列步骤中细胞超微结构的一些变化来确定保存方法。
    预培养降低了细胞的液泡化程度，线粒体嵴变得更为发达，同时细胞的代谢活性增加，而未经预培养的细胞冻后很难存活[52]，由此说明，细胞超微结构的这些变化为抗冻力和抗寒力提高的标志。
    保护剂处理为超低温冻存中的关键环节，细胞只有脱去足够的水分，才能在快速冷冻时无冰晶生成，进入玻璃化状态。但经保护剂处理后也可造成细胞损伤，从超微结构上看引起核周隙扩张、膜囊泡化及细胞骨架的塌陷瞬。
    冷冻这一环节不同的保存方法对细胞的损伤程度也不同，两步冰冻法由于有冰晶的生成，造成细胞膜有不同程度的损伤;而玻璃化法由于用高浓度的玻璃化保护剂处理，然后快速投入液氮储存，细胞内外都进入了均一的玻璃化态，这是一种没有冰晶的状态，对细胞的损伤小。恢复生长过程中，经过连续的电镜观测，发现细胞损伤一般被慢慢地修复，说明冻存各步骤的损伤为可逆的。

6超低温保存过程中的遗传稳定性检测方法
    超低温保存前处理步骤涉及到一系列胁迫过程，包括渗透胁迫、低温胁迫等，这些胁迫可能作为一种选择压对不同基因型的植物材料产生选择效应，有研究表明超低温保存导致了一些细胞系的次生代谢物合成能力以及胚性和恢复生长能力的变化，可能就是种选择效应造成的。对于组成均一的材料，超低温保存过程中一般不会发生遗传变异，章志宏等对水稻单倍体不定芽超低温保存的研究表明，再生后代的表型和基因型特征都没有变化。在对外植体进行超低温保存时可采用生长和遗传均一的材料，以避免和减轻这种筛选效应，同时，利用某项超低温保存技术进行大规模长期保存之前，对其进行遗传稳定性检测也是必要的。
    作为基因型易于识别的表现形式，遗传标记(genetic markers)在植物种质资源的遗传稳定性研究工作中有着十分重要的地位。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记(morphological markers)、细胞标记(cytological markers)、生化标记(biochemical markers)和分子标记(molecular markers)。
 形态标记是指植物的外部特征的标记。从形态学或表型上检测遗传变异是常用也是简单的方法，有关形态的质量性状变异在众多类型的无性系变异中是容易鉴别的，这些变异主要包括株高、叶形、枝刺和叶面绒毛的有无等。
    细胞标记是指染色体数目及核型和带型的标记。染色体数目和结构变异以及异常染色体行为在组织培养中是很常见的现象。染色体数目变异包括整倍体变异和非整倍体变异。染色体结构变异包括易位、倒位、重复和缺失。异常的染色体行为包括姊妹染色单体交换频率增加和体细胞染色体联会频率的增加。生化标记是指同工酶和贮藏蛋白的标记。蛋白质是基因表达的直接产物，植物中蛋白质成分的变化反应了遗传物质及其表达的变化。
    同工酶是指催化反应相同而结构和理化性质不同的一类酶。在科学研究上，同工酶作为一种高灵敏度的遗传标记己经引起了人们的极大关注。同工酶存在于植物体的各个部位，不同生育期，不同组织和细胞中。从分子生物学的角度看，同工酶是由基因编码的。与基因的关系可以分为四种:(l)单基因决定的同工酶;(2)多基因决定的同工酶;(3)复等位基因决定的同工酶;(4)修饰同工酶和次生同工酶。
    分子标记是直接在DNA分子水平上检测生物个体间差异的一种标记，是DNA水平遗传变异的直接反应。DNA分子标记能对各个发育时期的个体，各个组织器官甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，稳定性好。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣。在短暂的几十年，经历了迅猛的发展，分子标记日趋成熟。目前，己经出现的分子标记技术有几十种，常用的有如下几种:RFLP (Restriction Fragment Length polymorphism)、染色体原位杂交(Chromosome In situ Hybridization)、RAPD(Randomly Amplified polymorphic DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)。
    RAPD标记，即随机扩增多态性DNA，是由美国科学家Williams和Welsh几乎同时提出的一种基于PCR的分子标记。它以DNA为模板，利用10核昔酸随机引物进行PCR反应，由于植物基因组DNA的差异，引物与基因组DNA的结合区域就不同，因而，结合引物之间的间距就不同，PCR产物的大小表现为多态性,即对于同一模板DNA，用某一特定引物进行扩增，所得到的电泳带图谱应是一致的，引物不同，谱带会有差异。而对不同的模板DNA，用同一引物扩增，既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性)，也可能得到不同的带谱，仅在某一特定引物中出现的一条带就可以作为该模板的分子标记。理论上讲，只要基因组DNA有一点儿差异，RAPD标记就有差异。在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。所以，它是在全基因组水平上检测DNA变异的一种快速、有效的技术体系。RAPD的主要优点是简单易行，需DNA量极少(15-25ng)，无须事先知道DNA序列，也无须放射性同位素，所揭示的多态性高。缺点是存在重复性差的问题，这一点可以通过选用精密仪器和严格实验操作加以控制。
    离体保存中的变异可以体现在从形态到DNA的各个不同水平上，所以检测的方法也应建立在不同层次上，它们在理论和实际研究中都有各自的优点和局限，但不管研究在怎样的层次上进行，都能够有效的揭示遗传物质的变异。
7超低温保存的发展趋势与前景展望
    超低温保存为果树的品种改良、快速繁殖和脱毒繁殖奠定了基础。加世纪70年代以来，这一领域的研究己取得了很大进展，然而，至今仍未建立起专有物种的种质资源库，故今后建立种质资源库己成为超低温保存的趋势，也是园艺学研究的一个重要方向，超低温保存技术在园艺学上的重要性应得到充分的认识。以建立苹果茎尖分生组织为材料的种质超低温保存库为例，可将现有的全部苹果种质长期储存于十几平方米的室内，在保证种质遗传稳定性的同时，可大量节省土地和开支，为果树学研究和种质改良提供有利的保障和便利。超低温保存作为一项全新的生命保存技术，必将展现着不可限量的应用前景。