CTAB法提取植物基因组DNA过程图示
主要试剂:
(1) 1M Tris-HCl (pH8.0)
(2) CTAB分离缓冲液
2% CTAB, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris-HCl (pH8.0),0.2%β-巯基乙醇,3% PVP共100ml:2g CTAB,8.18g NaCl, 0.74g EDTA.2Na.2H2O, 3g PVP, 加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0),加水定容到100ml。高压灭菌,室温保存(注:β-巯基乙醇不能进行高压灭菌,用时加入即可!)
(3)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 氯仿:异戊醇(24:1)
(4)TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0),1mmol/L EDTA
(5)3M NaAc 乙醇(75%,95%,100%)
(6)液氮
步骤:
(1)水浴锅升温至65℃,CTAB提取缓冲液置于水浴锅中预热,95%乙醇置于冰箱预冷,
(2)液氮研磨(研磨前研钵先用液氮预冷)注意戴手套,防冻伤!
(2)将粉末转移置2ml离心管中,加入800ul CTAB,充分混匀水浴1h,期间每隔5min,上下轻摇数次
(3)将离心管从水浴锅中取出,放置至室温,加等体积入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1){酚贵,但效果更好!直接用氯仿:异戊醇(24:1)}上下轻轻颠倒数次
(4)10000 rpm 4℃离心10min,取上清,用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)或氯仿:异戊醇(24:1)继续抽提至没有白色界面为止
(5)离心——取上清——抽提至无白色界面,小心吸取上清于另一1.5ml离心管中,加入2/3预冷的95%乙醇,NaAc使其终浓度为0.25mol/L,-20℃冰箱放置3小时或过夜。
(6)收集DNA
如果呈可见的丝状DNA,可用剪掉尖头的枪头吸取,转移至70%乙醇中进行洗涤
如果DNA呈现云雾状,可直接离心,小心地倒掉上清液,在松散的沉淀中加入70%乙醇中进行洗涤
(7)洗涤两遍,再用无水乙醇洗一遍,离心去上清,用灭菌的滤纸条将离心管口的乙醇吸干,倒置于超净工作台上自然风干
(8)风干至没有乙醇味,DNA周边发亮时,加入50ulTE缓冲液,-20℃冰箱保存
(9)0.8%琼脂糖凝胶电泳(图暂缺)
(10)紫外分光光度计测其DNA的纯度及含量
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