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分离猪胚胎干细胞方法

作者:液氮罐 日期:2016/12/13 8:13:15 信息来源:http://www.tcyedanguan.com/

猪胚胎分离培养体系会改变细胞核移植胚胎、孤雌胚胎和体内胚胎多能基因的表达,也会影响猪多能干细胞形成的效率和质量。分离猪胚胎干细胞是至关重要的,分离方法如下:

细胞培养:用于核移植供体的猪胎儿成纤维细胞从初生猪仔的耳部分离得到。细胞培养基为DMEM15%胎牛血清,培养温度为37℃,5%CO2。细胞冻存,使用0.25%W/V)的胰蛋白酶消化,中和后离心200×g5min。将细胞重悬后并加入等量冻存液(40%DMEM40%FBS20%DMSO),贮存在液氮中。

卵母细胞的收集和准备:从屠宰场收集猪卵巢,保存在含有青/链霉素的生理盐水中,运输温度32~38℃,3h内运回实验室。采用抽吸法采集卵巢卵母细胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母细胞置于15mL离心管中,37℃水浴静置数分钟,待卵母细胞沉降后,用洗卵液洗2遍,显微镜下挑取颗粒细胞层达3层以上的卵丘卵母细胞复合物,然后将COCs转入U型皿中培养42~44h,每孔加500µL成熟培养液,每孔放置50~70枚。

孤雌激活和胚胎培养:用电融合仪将成熟的卵母细胞进行电激活,漂洗后,将卵母细胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分别将卵母细胞转移到胚胎培养基G1NCSU23和猪受精卵培养基,24h后记录卵裂率。3d后,将培养基G1中发育的胚胎移入囊胚培养基G2。再次培养3~4d后,统计囊胚个数并收集。

体细胞核移植胚胎培养:去除成熟卵母细胞第一极体,随后注入供体细胞。显微操作后,移入含10%FBSM199培养基,在38.5℃,5%CO2条件下孵育0.5h,使用电融合仪进行激活处理,移入6D孵育2.5h后,将重组胚胎在NCSU23培养基中培养3d,随后替换NC-SU23继续培养3~5d,观察胚胎的发育。

体内胚胎的收集:从人工受精的母猪体内收集第7~8d的囊胚,所有方法参照Stokes等。每天监测母猪的发情,将发情日期作为0d,鉴定发情后的61218h进行人工受精。从子宫冲洗胚胎时使用预热的含10%FBS的磷酸缓冲盐溶液。

从猪胚胎分离胚胎多能干细胞:将去除透明带的囊胚接种到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上2~4d,囊胚内细胞团在3~5d后出现。待ICM大小适中时,用机械法分离细胞,重铺到新的饲养层上,并使用不同的猪胚胎干细胞培养基,胚胎多能干细胞克隆每5~7d使用机械法传代。

免疫荧光检测:使用4%多聚甲醛固定胚胎10min,PBS洗2次后,加入0.25%Triton-X室温30min,PBS洗3次,1%BSA室温封闭1h,4℃孵育一抗24h1∶200,CDX2;1∶200NANOGPBS冲洗3次,孵育荧光标记的二抗1∶1000室温1h。PBS冲洗2次后,DAPI染色2min,PBS冲洗2次后在荧光显微镜下观察照相。

qRT-PCR:使用0.5%链霉蛋白酶A去除猪胚胎的透明带后,立刻加入5μL的裂解缓冲液5mmol/L二硫苏糖醇dithiothreitol,DTT,1%NP-40,1U/uLRNA酶抑制剂,冰上孵育30min。使用反转录试剂盒将裂解液反转录为cDNA。qRT-PCR体系:cDNA2μL,SYBRgreenmix12.5μL,上下游引物各0.3µmol/L0.5μL,ddH2O补充到25μL。反应程序:95℃30s;95℃5s,60℃30s,共40个循环。

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