1胚性培养物和愈伤组织的组织学观察

组织学切片显示了胚性培养物和愈伤组织在细胞学上的差异。胚性培养物结构紧密，所有细胞的细胞质和细胞核染色深，核质比高，表明胚性培养物的细胞分裂活力旺盛（图1-A）。愈伤组织的结构疏松，呈放射状增殖，且整个愈伤组织除外部细胞染色较深外，其他细胞的细胞核和细胞质染色浅，说明愈伤组织只有外部边缘的细胞具有较旺盛的分裂活力（图1-C）。

细胞内含物的组织学切片也表明胚性培养物与愈伤组织的细胞存在着差异，胚性培养物细胞具有大量的淀粉粒内含物，且内含物在培养物内的分布较均匀（图1-B）；而愈伤组织的细胞几乎不含有内含物，细胞染色浅（图1-D）。

图1芒果子叶外植体胚性培养物和愈伤组织的组织学观察

A：胚性培养物,甲苯胺蓝染色；B：胚性培养物,希夫试剂染色；C：愈伤组织,甲苯胺蓝染色；D：愈伤组织,希夫试剂染色。

2胚性培养物和愈伤组织的细胞周期分析

采用流式细胞仪对芒果胚性培养物和愈伤组织的细胞周期分析结果表明，胚性培养物的细胞分裂增殖活力远高于愈伤组织。在所分析的胚性培养物细胞群体中，处于DNA合成期（S）的细胞数约为43.5%，处于细胞分裂间期2（G2）的细胞数约为1.8%，可以算出胚性培养物中处于分裂过程的细胞约占总细胞数的约45.3%，而愈伤组织中处于分裂过程的细胞只占总细胞数约15.4%。这说明胚性培养物的细胞内的DNA合成活性和细胞的分裂活性均高于愈伤组织细胞（图2）。

G1：细胞分裂间期1；G2：细胞分裂间期2；S：DNA合成期。

3胚性培养物和愈伤组织的脱水耐性比较

芒果胚性培养物和愈伤组织对低温保护剂的脱水耐力不同。在低温保护剂脱水处理5min后，胚性培养物的存活率没有改变，但愈伤组织的存活率却降低到46.6%左右。进一步延长脱水时间至处理30min，此时已无愈伤组织存活，而胚性培养物则仍保持了96.7%左右的存活率（表1）。

虽然低温保护剂脱水处理5和15min后，仍有部分愈伤组织存活，但在超低温保存后的存活率均为0。与之相反，胚性培养物在脱水处理5min后，即有约77.7%的胚性培养物超低温保存后存活。而脱水处理30min后，则有约94.7%的胚性培养物存活（表1）。

表1脱水处理对胚性培养物和愈伤组织存活率的影响

4胚性培养物和愈伤组织超低温保存后的冷冻切片显微观察FDA荧光冷冻切片观察证实，未经脱水处理的胚性培养物和愈伤组织在超低温保存后，细胞均失去荧光（图3-A和B）。脱水处理30min和超低温保存后，在愈伤组织细胞上虽仍然不能观察到荧光（图3-D），但在胚性培养物上则观察到了大量具有强烈荧光的细胞（图3-C），显示不仅这些细胞内的酯酶在超低温保存后仍具有活力，而且其细胞膜系统在超低温保存后也保持了正常的功能。

图3胚性培养物和愈伤组织细胞超低温保存后的冷冻切片FDA荧光观察

A：未经脱水处理的超低温保存后的胚性培养物细胞；B：未经脱水处理的超低温保存后的愈伤细胞组织细胞；C：脱水处理30min和超低温保存后的胚性培养物细胞；D：脱水处理30min和超低温保存后的愈伤组织细胞。标尺=2mm。

5低温保护剂脱水处理对胚性培养物细胞超低温保存后存活的影响

FDA荧光冷冻切片技术不仅可以更准确观察到胚性培养物在超低温保存后细胞的存活率，而且还可以观察到存活细胞在胚性培养物内所处的部位。超低温保存后的未经脱水处理的胚性培养物细胞上没有观察到具有活力的细胞（图4-A），而仅采用5min的低温保护剂脱水处理，在超低温保存后的胚性培养物上即有部分细胞（约10%）保持了活力，具有强烈荧光，并且观察到这些细胞均分布在胚性培养物的外部（图4-B）。将低温保护剂脱水处理时间延长至15min，超低温保存后的胚性培养物上观察到了更多有活力的细胞（约50%），并且有荧光的细胞的分布部位在胚性培养物内由外部延伸到胚性培养物的内部（图4-C）。而采用低温保护剂脱水处理30min的胚性培养物，在超低温保存后具有活力的细胞更多（约70%），并且这些细胞在胚性培养物内的分布更为均匀（图4-D）。这说明随着脱水处理时间的延长，胚性培养物的细胞由外到内逐步得到充分的脱水，而且随着脱水时间的延长，低温保护剂也逐渐渗入到细胞团的内部，对内部细胞保护作用也增强。

图4冷冻切片FDA荧光观察脱水处理时间对胚性培养物细胞超低温保存后存活的影响

A：超低温保存后的未经脱水处理的胚性培养物细胞；B：脱水处理5min和超低温保存后的胚性培养物细胞；C：脱水处理15min和超低温保存后的胚性培养物细胞；D：脱水处理30min和超低温保存后的胚性培养物细胞。标尺=2mm。