河南天驰液氮罐有限公司
公司地址:郑州市,中原区,大学科技园


联系人:张经理
手机:18903712477 / 15290868205
QQ: 648486900

首页 > 技术支持 > 文章内容

影响精子超低温冷冻保存效果的因素

作者:液氮罐 日期:2017/5/9 8:04:12 信息来源:http://www.tcyedanguan.com/

1.稀释液及抗冻剂对精子超低温冷冻保存效果的影响
稀释液为精子提供一个适宜的生理环境,延长其在,并防止精子被激活。稀释液的冷冻保存效果与其渗透压、pH及离子组成密切相关,精子可被与精浆等渗或接近等渗的溶液抑制;酸性溶液会降低或抑制精子运动;高浓度K+能抑制精子活动,而Na+、Ca2+、Mg2+能缓解或部分缓解这种抑制。不同种鱼类精子生理特性不同,适宜的稀释液也不尽相同。Fauvel等以MMM液为稀释液、10%DMSO为抗冻剂超低温冷冻保存条纹狼鲈精子,冻精激活率与鲜精之间无显著差异。Chen等以TS-2液为稀释液,10%、14%DMSO为抗冻剂超低温冷冻保存大菱鲆精子,激活率达(78.3±7.6)%和(76.6±5.8)%。Koh等以FBS为稀释液,5%DMSO为抗冻剂冷冻保存七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)精子,激活率达(77.6±8.5)%。
本研究所选的3种稀释液在海水鱼类精子超低温冷冻保存中较常用。如以HBSS液为稀释液、5%—20%DMSO为抗冻剂冷冻保存的黄姑鱼精子激活率达(79.25±3.86)%—(85.25±3.95)%;以MPRS液为稀释液、10%DMSO为抗冻剂冷冻保存的中国花鲈精子激活率达(68.3±4.4)%;以Cortland液为稀释液、10%DMSO和10%Gly为抗冻剂冷冻保存的黑鲷和大黄鱼精子,激活率高分别达(92.91±1.25)%和(89.93±1.07)%。本研究以Cortland液为稀释液、10%EG为抗冻剂超低温冷冻保存的精子激活率较高,达(87.33±2.52)%。分析认为,与HBSS、MPRS液相比,Cortland液的渗透压、pH及离子环境可以更好地抑制中国花鲈精子运动,提高冻后精子活力。因此,Cortland液适宜作为中国花鲈精子冷冻保存用稀释液。
抗冻剂的作用是在溶液中结合水分子,发生水合作用,使溶液的黏性增大,从而弱化水的结晶过程,达到保护精子的目的;不同种鱼类精子适宜的抗冻剂种类及浓度有所不同。Zhang等以12%DMSO和12%Gly为抗冻剂冷冻保存牙鲆精子,激活率分别达(60.5±3.6)%和(79.17±4.5)%;Chen等以10%—14%DMSO为抗冻剂冷冻保存大菱鲆精子,激活率达(76.6%±5.8)%—(78.3±7.6)%,而以10%PG为抗冻剂时,激活率下降为(51.7±2.9)%;以5%—20%EG为抗冻剂冷冻保存大黄鱼精子,激活率达(81.25±2.30)%—(87.50±2.52)%,与鲜精相比无显著差异;以5%—20%Gly为抗冻剂冷冻保存大黄鱼精子,激活率达(83.98±2.70)%—(89.93±1.07)%,与鲜精无显著差异。本实验采用Gly、DMSO、EG及PG四种常用抗冻剂超低温冷冻保存中国花鲈精子,其效果是EG>PG>DMSO>Gly,其中以10%EG为抗冻剂时精子活力高,激活率、运动时间和寿命分别达(87.33±2.52)%、(15.23±0.81)min和(20.00±0.68)min,与鲜精相比无显著差异。分析认为,EG分子量相对较小,其渗透性比PG、DMSO及Gly高,能更快速地进入中国花鲈精子,与水结合,弱化结晶过程;10%EG既能起到良好的抗冻保护作用,又不会因其浓度过高而导致精子中毒。因此,中国花鲈精子冷冻保存宜选用10%EG为抗冻剂。
精液与抗冻液的稀释比是影响精子冷冻保存效果的又一重要因素,适宜的稀释比能使稀释液充分渗透入精子细胞。不同种鱼类精液中精子密度及其生理特性不同,适宜的稀释比也会有所不同。据报道,大菱鲆精子的冷冻保存试验,稀释比从1︰1升高到1︰9,精子激活率无显著变化。黄姑鱼、真鲷和大黄鱼精子冷冻保存试验,稀释比1︰3,冻精激活率高分别达(85.25±3.95)%、(81.0±5.4)%和(89.93±1.07)%。以1︰1稀释比冷冻保存中国花鲈精子,冻精激活率高达(73.3±5.7)%。本研究的中国花鲈精子超低温冷冻保存试验,稀释比为1︰3时激活率达(87.33±2.52)%,稀释比大于或小于1︰3时激活率明显下降。分析认为,稀释比1︰3时,稀释液能充分渗透入中国花鲈精子,这一稀释比适于中国花鲈精子冷冻保存。
2.降温高度对精子超低温冷冻保存效果的影响
简易降温装置-两步降温法是鱼类精子冷冻保存的常用方法,它通过设置冻存管距离液氮面的高度及停留时间来控制降温速率。当距液氮面高度增加、降温减慢时,细胞外冰晶形成速度快于细胞内,导致细胞因暴露于较高浓度环境中而脱水产生渗透休克,而当距液氮面高度降低、降温加快时,细胞内水分来不及渗出,细胞因形成冰晶而刺破细胞膜和细胞器等结构,导致细胞死亡,所以当距液氮面的高度高于或低于适宜高度时,冻精激活率降低。不同种鱼类精子适宜的降温高度有所不同。
对七带石斑鱼精子的冷冻保存试验是在距离液氮面高度2.5、5.0、7.5及10cm处先降温至-50℃,然后投入液氮中保存,各高度组冻精激活率无显著差异。在距离液氮面6.5cm高度降温15min与在2及13cm高度处降温相同时间冷冻保存大菱鲆精子,其激活率分别达(81.1±3.6)%与(56.7±4.6)%及(74.7±4.9)%。对大黄鱼精子的冷冻保存试验是在距离液氮面3—4cm处降温3—5min,然后投入液氮中保存,冻精激活率达(83.98±2.70)%—(89.93±1.07)%。试验发现,花鲈精子在距离液氮面2、6及13cm高度处降温10min,接着在液氮面停留5min后投入液氮中保存,冻精激活率分别为(41.7±10.6)%、(73.3±5.7)%及(48.3±2.9)%。本研究5个不同的液氮面设置高度(2.5、5、7.5、10及12.5cm)代表5组不同的降温速率,其中以7.5cm高度组冻精激活率高,达(87.33±2.52)%,与鲜精无显著差异。分析认为,在此降温高度,细胞内冰晶的形成和渗透休克(溶液效应)可能都降低。因此,两步降温法冷冻保存中国花鲈精子宜选择液氮面设置高度7.5cm。
3.超低温冷冻保存对精子能量代谢酶及抗氧化酶活性的影响
精子的ATP酶、SDH及LDH等能量代谢相关酶活性与精子的活力密切相关,可作为精子质量评价的重要指标。据研究,长鳍篮子鱼精子和日本鳗鲡(Anguillajaponica)精子在超低温冷冻保存后总ATP酶、SDH活性显著降低,活力明显下降;黄鳝(Monopterusalbus)精子在冷冻保存后LDH活性显著下降,活力明显降低。虹鳟(Oncorhynchusmykiss)精子在超低温冷冻保存后LDH活性显著下降,活力明显受影响。精子超低温冷冻保存后能量代谢酶活性的降低可能是因为精子冷冻过程中酶类物质结构受损,也可能是因为精子冻融过程中的机械损伤、细胞膜结构改变,导致精子内的酶类物质溢出。
本文地址:http://www.tcyedanguan.com/cnews/1408.html