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一种适用于现场条件的液氮低温保存技术

作者:液氮罐 日期:2017/6/13 8:09:17 信息来源:http://www.tcyedanguan.com/

本文介绍了一种增进布鲁属丝虫微丝坳发育适用于现场的液氮低温保存技术。
腹腔灌洗法从已感染的沙鼠腹腔获取马来丝虫和彭亨丝虫微丝坳,置TC199培养液中洗涤,采用改良的HAM法(1981年,第一步,将微丝坳放进10%v(/v)乙二醉(ED)37OC孵育巧分钟,第二步,转至碎冰上,在40%ED液中孵育45秒钟,然后将滴有20电微丝勤悬液的盖片投入液氮(-196oC)低温保存,复苏时将每张盖片迅速转移至3700装有至少lmlTC199液(含20终热灭活新鲜胎牛血清)试管中,轻轻摇动,以两种方法评价复苏后微丝坳的存活水平。
一种是于37℃显微镜下观察微丝坳的活动能力,以显示正常活动的微丝勤占20闪中微丝勤总数的百分比表示,各组标本重复3次;
另一种是观察低温保存和未作处理的微丝坳在埃及伊蚊(eBlsNewtSarin)体内充分发育的能力,以评价其生活力,即以每毫升含9000条微丝勤与鼠血混合,在37℃下,按Ruuedge法通过猪肠膜喂食蚊子,保持室温28℃,并喂以4拓(w/v)蔗糖液,同时设喂食无微丝拗鼠血加蔗糖和仅给予蔗糖液对照组,以评价由于微丝坳导致的蚊虫死亡率,10天后,从每个感染组随机选择45只蚊子置入TC199液,分头、胸、腹进行个体解剖,检查幼丝虫,并记录各组蚊虫死亡率。
结果:采用两步或单用第二步孵育而未进行低温保存的微丝蝴,存活水平下降,二者结果经方差分析无显著性差异;经乙二醉两步法孵育置入液氮保存,复苏后45秒钟内微丝勤存活增至90%左右,如果不给于起初的3700孵育,低温保存复苏后30秒钟内存活率约为26.6%,比较乙二醇两步孵育液氮保存复苏后微丝坳和对照组微丝坳活动力,经5次重复试验,前者显示正常活动的马来微丝坳平均为后者的91%左右;实验结果还证实,用低温保存或不作处理的微丝坳与鼠血混合,及用鼠血继之用蔗糖或仅给予蔗糖喂食埃及伊蚊,10天后4组蚊虫存活率在75.1-80.8%,说明微丝勤对蚊虫存活力无影响,当用低温保存的彭亨丝虫微丝蝴与鼠血混合喂食埃及伊蚊,10天后解剖,平均每只蚊可检获4.04条nl期幼虫(II期幼虫略有增加,但未发现I期幼虫),未冷藏对照组,每只蚊平均可检获5.16条111期幼虫,前者感染水平约为后者的78形。
作者认为,上述改良法与其它报道的方法不同,勿需精密设备,仅要一些冰和液氮,适于带鞘微丝勤的冷藏和现场应用。
在后肢蹂趾部穿料,滴加含50条感染性幼虫的生理盐水一滴,而后将猴分笼饲养。感染后l~21个月,将50~100四i的碍标记硫胶体注射入每只后肢的蹼趾,用射线照相术检测从注射部位经淋巴管进入脑,腹骨盆淋巴结的放射性同位素含量,每隔数十分钟测量1次,共3小时。试验时对照组后肢呈屈曲状的有9肢次,伸直状的有6肢次,以观察后肢屈曲对淋巴液流动的影响。同位素试验完毕后数天,在后肢蹼部注射天蓝染料使淋巴系统着色,十分钟后将猴麻醉剖腹,在原位用解剖镜检查淋巴系统。

对照组15肢次不论后肢屈曲或伸直,其标记胶体早在注入后10分钟出现于胭淋巴结,为10~30CPM,30~120分钟可在大部分后肢的腹一骨盆淋巴结测得10~30CPM,但其中有4胶次的胶体于3小时内尚未到达腹一骨盆淋巴结。试验组8肢次在感染后1~9个月,标记胶体于注入后30~120分钟时首先在腹一骨盆淋巴结测得10~7OOPM,其中4肢次在腹、骨盆淋巴结出现10~40分钟后才在服淋巴结测得,另4肢次则胶体从未在胭淋巴结出现。感染后n~21个月,则胶体先在胭淋巴结测得IOCPM,然后在腹一骨盆淋巴结测得,其回流方式与对照组相似,仅回流量较对照组低。淋巴系统染色检查显示,对照组后肢的染料通过两支细小的淋巴管到达胭淋巴结,后者被染成暗蓝色。腹股沟淋巴结为浅蓝色。而感染丝虫的后肢于1-9个月时,发现在4支淋巴管中有2支扩张弯曲,呈暗蓝色,亦有扩张为3~4~长的袋状淋巴管。在踵部与胭淋巴结之间的曲张淋巴管内有5条丝虫,1s/腹股沟淋巴结着暗蓝色。感染后n个月以上淋巴系统的结构与着色方式与对照组后肢相似。

上述试验表明帕塔斯猴受丝虫感染后,后肢帼淋巴结部分阻塞,其下淋巴管曲张,并有侧肢形成,感染后11个月以后阻塞现象消失。

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